注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理

VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体12mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体18mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体18mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。

细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

血清：直接测定。

测定操作

	空白管	测定管
样品（μL）		200
试剂一（μL）	200
试剂二（μL）	200	200
试剂三（μL）	300	300
试剂四（μL）	300	300
充分混匀，25℃反应20min，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定390nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。

计算公式

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量计算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×Cpr）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.36359 ×V反总÷（V样×W÷V样总）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷V样

=13.76×（△A - 0.0205）

V反总：反应总体积，1mL；：V样：加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。

显色完成后立即进行测定。