注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB1在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体35mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体12mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。

细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g离心10min，取上清测定。

血清：直接测定。

测定操作

	空白管	测定管
样品（μL）		100
试剂一（μL）	100
试剂二（μL）	80	80
试剂三（μL）	100	100
充分混匀，80℃反应10min
提取液（μL）	80	80
试剂四（μL）	220	220
试剂五（μL）	120	120
H2O（μL）	300	300
充分混匀，静置20min，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。

计算公式

标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）

1. 按照蛋白含量计算

VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr

= 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V样总）

= 58.8×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V样总）

= 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017

= 58.8×（△A-0.0031）

V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。

显色完成后立即进行测定。

标准曲线线性范围为0.1-10μg/mL。