注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

尿素是生物体内含氮化合物分解的终产物，在尿酶催化下分解转化成氨。血液尿素氮是肾功能的主要指标之一。

测定原理

样本中尿素氮在氯化高铁一磷酸溶液中与二乙酰一肟和硫胺脲共煮，生成一种红色的二嗪化合物，其颜色的深浅与尿素氮含量成正比，采用二乙酰一肟法测定尿素氮含量。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、常温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存，

试剂二：液体60mL×1瓶，4℃避光保存。

样品处理

组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL蒸馏水）加入蒸馏水，匀浆后于25℃，10000g离心10min，取上清待测。

细胞：按照细胞数量（104个）：蒸馏水体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL蒸馏水），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

血清或其它液体：直接检测。

测定操作

	空白管	测定管
样品（μL）		20
H2O（μL）	20
试剂一（μL）	50	50
试剂二（mL）	500	500

混匀，沸水浴10min，冷却后，540nm下测定吸光值。△A=A测定-A空白。空白管只要做一管。

尿素氮含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y =2.048x + 0.0229，R2 = 0.9943；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

1、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算

尿素氮含量(mg/mL)= (△A-0.0229)÷2.048=0.4882×(△A-0.0229)

2、按照样本质量计算

尿素氮含量mg/g鲜重)= (△A-0.0229)÷2.048×V样总÷W=0.4882×(△A-0.0229)÷W

3、按照蛋白浓度计算

尿素氮含量(mg/mg prot)= (△A-0.0229)÷2.048÷Cpr=0.4882×(△A-0.0229) ÷Cpr

V样总：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y = 1.024x + 0.0229，R2 = 0.9943； x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

1、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算

尿素氮含量(mg/mL)= (△A-0.0229)÷1.024=0.9766×(△A-0.0229)

2、按照样本质量计算

尿素氮含量(mg/g鲜重)= (△A-0.0229)÷1.024×V样总÷W=0.9766×(△A-0.0229)÷W

3、按照蛋白浓度计算

尿素氮含量(mg/mg prot)= (△A-0.0229)÷2.048÷Cpr=0.9776×(△A-0.0229) ÷Cpr

V样总：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。