注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

测定原理

羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水，无水乙醇，乙酸乙酯。

试剂组成和配制

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加1mL水溶解，每支为10个样品用量）

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。

试剂六：液体100mL×1瓶，4℃保存。

样品处理

组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，于4℃，4000g离心10min，取上清，加入0.1mL试剂一，室温放置10min，4℃，10000g离心10min，取上清待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体样本：直接测定。

测定步骤和操作表

	对照管	测定管
样品（mL）	0.2	0.2
试剂二（mL）		0.4
试剂三（mL）	0.4
混匀，37℃避光反应1h
试剂四（mL）	0.5	0.5
静置5min，4℃，12000g离心15min，弃上清，留沉淀
试剂五（mL）	1.0	1.0
漩涡混匀，4℃，12000g离心10min，弃上清，留沉淀
试剂五（mL）	1.0	1.0
漩涡混匀，4℃，12000g离心10min，弃上清，留沉淀
试剂五（mL）	1.0	1.0
漩涡混匀，4℃，12000g离心10min，弃上清，留沉淀
试剂六（mL）	1.0	1.0
漩涡混匀，37℃温育15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000g离心15min，取上清，1mL玻璃比色皿，试剂六调零，分别记录370nm对照管和测定管在的吸光值，ΔA370 =A370测定管－A370对照管

计算公式

按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反总÷（ε×d）]÷(V样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

按照样本重量计算

蛋白质羰基含量（μmol/g 鲜重）= [ΔA370×V反总÷（ε×d）]÷(W ×V样÷V样总) =0.227×ΔA370÷W

3. 按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反总÷（ε×d）]÷(细胞数量 ×V样÷V样总) =0.227×ΔA370÷细胞数量

按照液体体积计算

蛋白质羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反总÷（ε×d）]÷V样=0.227×ΔA370

V反总：反应体系总体积，1mL；ε：羰基微摩尔消光系数，22×10-3 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.2 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g

注意事项

1. 试剂一使用之前根据要测定的样品数现配，配置好后4℃保存，若变为黑色，则不能使用。

2. 试剂二见光易分解，反应需严格避光。