正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PEPC（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。

测定原理：

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO42-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，计算PEPC活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体30 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：液体10 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂三：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入4mL蒸馏水充分溶解待用；现配现用。

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五 ：原液20μL×1支，4℃保存；

试剂五：稀释液10mL×1瓶，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

试剂五工作液的配制：将试剂五原液：试剂五稀释液=1μL:329μL稀释，用多少配多少。

将试剂一、二、三、四和试剂五工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。

加样表：

试剂名称(μL)	测定管
试剂一	500
试剂二	150
试剂三	150
试剂四	95
试剂五工作液	95
样本	20

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应5分钟后的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2。

注意事项：如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、和试剂五工作液按比例配成混合液。

PEPC活性计算：

1、血清（浆）PEPC活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1624×ΔA

2、组织、细菌或细胞中PEPC活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1624×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1624×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.248×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.010×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。