正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

叶绿体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂三：6mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂七：液体10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

叶绿体的提取：

称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，很快研磨或捣碎，30秒内完成，使之成为匀浆液。

将匀浆液于200g（离心率），4℃离心1min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，1500g，4℃离心5min。

弃上清液，于沉淀中加入0.5mL试剂一混匀配成叶绿体悬浮液。混匀后测定叶绿体酶活性。

测定步骤

1、酶促反应

试剂名称（μL）	对照管	测定管
试剂二	25	25
试剂三	100	100
样本		125

试剂四	50	50
样本	125

混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min

上清液	170	170
定磷试剂	830	830

混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液

2、定磷

混匀，室温静置10min左右，在660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。

复合体Ⅴ活性计算

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)

V反总：反应体系总体积，3×10-4 L； V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取液体积，0.5 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。