注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。

测定原理

DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在460nm处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体0.6mL×1支，4℃保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接测定。

测定操作表

	对照管	测定管
粗酶液（μL）	250	250
提取液（μL）	640	540
试剂一（μL）	10	10
试剂二（μL）	100	100
试剂三（μL）		100
混匀，37℃水浴30min，1mL玻璃比色皿，对照管调零，测定A460

酶活性计算公式

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/g）= ×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T= 18×A460÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T= 18×A460÷细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T= 18×A460

ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样本体积，0.25mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min

注意事项

1、如果OD值小于0.01，适当加大提取用的样本质量； OD值大于0.8，粗酶液可适当稀释，或者减少提取用样本量。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。